С.Г. Дагаев, Л.Г. Кубарская, О.А. Филько, А.В. Храброва, Н.Е. Соловьева, Б.В. Долго-Сабуров, Л.Я. Либин, К.Н. Данилова, Н.Д. Ещенко «Некоторые механизмы формирования нарушений у крыс» (С.24-28)

Дагаев С.Г., Кубарская Л.Г., Филько О.А., Храброва А.В., Соловьева Н.Е., Долго-Сабуров Б.В., Либин Л.Я.*, Данилова К.Н.*, Ещенко Н.Д.*

НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКСТРАПИРАМИДНЫХ НАРУШЕНИЙ У КРЫС

Федеральное государственное учреждение науки «Институт Токсикологии» федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург, Россия

*Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия

Введение

В последние годы широко обсуждается вопрос взаимосвязи функционирования различных медиаторных систем, в том числе дофаминергической и глутаматергической, и свободно-радикальных процессов в связи с развитием осложнений нейролептической терапии.

Схожие вопросы решались исследователями в процессе изучения патогенеза болезни Паркинсона. Установлено, что при данном нейродегенеративном заболевани поражение дофаминергических нейронов чёрной субстанции и связанное с ним нарушение метаболизма дофамина и глутамата, всегда сопровождается активацией свободно-радикальных процессов, а тяжесть клинических проявлений достоверно коррелирует с изменением показателей равновесия между про- и антиоксидантной системами (Hall, 1994; Дубинина, 2004 и др.)

Задачей настоящего исследования являлось изучение двух моделей экстрапирамидных нарушений, полученных путем блокады дофаминергической (ДА) и совместной ДА и глутаматергической (NMDA) систем и поиск отличий в функциональном состоянии различных структур головного мозга (стриатум, гиппокамп и кора больших полушарий).

Методы исследования

Работа выполнена на взрослых самцах белых беспородных крыс (разведения питомника «Рапполово) массой 200-220 г. Исследование проводилось по стандартной схеме введения препаратов, которая представлена на рисунке. Двигательные нарушения (каталепсию) у животных вызывали внутрибрюшинным введением селективного блокатора дофаминовых Д2 рецепторов – нейролептика галоперидола в дозе 0,32 мг/кг.

За наличие калепсии принимали нахождение животного у бортика экспериментальной установки в «позе лектора» (крыса стоит на задних лапах, опираясь передними лапами о бортик) не менее двух минут. Действие галоперидола модулировали внутрибрюшинным введениием кетамина – неселективного блокатора глутаматных NMDA рецепторов в дозе 0,13 мг/кг.

Рис. 1 . Схема постановки эксперимента.

Как видно из рисунка, подобная постановка эксперимента давала возможность: обеспечить равные условия для обеих опытных групп животных — всем было сделано по две внутрибрюшинные инъекции; учесть различия времени наступления фармакологического эффекта галоперидола и кетамина. Тестирование на наличие каталепсии только два раза позволяло избежать формирования у крыс условного рефлекса.

Через 10 минут после второго тестирования крыс декапитировали и выделяли кору больших полушарий мозга, стриатум и гиппокамп. Ткани выделенных структур каждого животного делились случайным образом на четыре части для последующего определения в них количества связанного ацетилхолина, активности ферментов ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и супероксиддисмутазы (СОД), а также продуктов перкисного окисления липидов

Все эксперименты проведены с соблюдением норм гуманного обращения с животными.

В работе был использован метод определения АХ в тканях животных (Crossland, Slater, 1968). Измерение содержания «связанного» ацетилхолина проводили на следующий день биологическим методом на препарате спинной мышцы медицинской пиявки. Определение активности АХЭ проводили методом Эллмана (Ellman e.a., 1961).

Активность СОД определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм. Выделение липидов из тканей проводили по методу Фолча (Folch e.a., 1957). Количество фосфолипидов определяли по содержанию фосфора с помощью метода Бартлетта (Bartlett, 1959). Определение диеновых и триеновых конъюгатов, расчёт индекса Клейна проводили по методу Шведова и Полянского

(Шведова, Полянский, 1992). Основания Шиффа определяли по характерным спектрам флуоресценции с максимумами в области 360–370 нм и 430–440 нм соответственно (Bidlack, Tappel, 1973).Все методы, использованные для характеристики свободно-радикальных процессов, подробно описаны в пособии [3].

Результаты исследования

Была проведена комплексная оценка функционального состояния структур мозга, связанных с обменом дофамина, на основании интенсивности окислительного стресса, активности ключевого фермента антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазы (СОД) и состояния холинергической системы (уровень ацетилхолина (АХ) и активность ацетилхолинестеразы (АХЭ)), вовлеченной в формирование двигательных нарушений.

Интенсивность окислительного стресса оценивалась по состоянию процессов ПОЛ, при этом использовали комплекс показателей. Определяли изменения уровня первичных (ДК и ТК), промежуточных (МДА) и конечных (ОШ) продуктов ПОЛ. Рассчитывали индекс Клейна, характеризующий общую степень окисленности липидов. Полученные данные представлены в табл. № 1–3.

Таблица 1

Средние показатели содержания продуктов ПОЛ в стриатуме крыс (n=5-8)

ДК

нмоль/мг

ФЛ

ТК

У.е./мг ФЛ

ОШ

У.е./мг ФЛ

Индекс

Клейна

МДА

нмоль/г

ткани

Галоперидол 2,36±0,10 0,149*±0,01 172,5±8,7 0,296±0,119 0,102±0,004

Галперидол+

Кетамин 2,61±0,05 0,137±0,015 249,7*±38,1 0,335±0,001 0,098▼

Таблица 2

Средние показатели содержания продуктов ПОЛ в гиппокампе крыс

(n=5-8)

ДК

нмоль/мг

ФЛ

ТК

У.е./мг ФЛ

ОШ

У.е./мг ФЛ

Индекс

Клейна

МДА

нмоль/г

ткани

Галоперидол 2,14±0,24 0,143±0,031 218,80±24,62 0,293±0,104 0,076±0,001

Галперидол+

Кетамин 2,26±0,08 0,191*±0.017 228,19±33,61 0,231±0,008 0,076▼

26

Журнал «Асимметрия» Том 2, № 4, 2008

Таблица 3

Средние показатели содержания продуктов ПОЛ в коребольших полушарий крыс (n=5-8)

ДК

нмоль/мг

ФЛ

ТК

У.е./мг ФЛ

ОШ

У.е./мг ФЛ

Индекс

Клейна

МДА

нмоль/г

ткани

Галоперидол 2,92±0,65 0,303*±0,20 122,83±21,59 0,367±0,144 0,079±0,004

Галперидол+

Кетамин 2,71±0,34 0,154±0,03 157,80±22,47 0,371±0,076 0,090▼

Во всех таблицах условные обозначения:

* — достоверность различия средних (Р<0,05) при сравнении группы галоперидол с

группой галлоперидол + кетамин

▼- единичные определения

Состояние системы антиоксидантной защиты оценивали по активности

СОД (табл.4)

Таблица №4

Активность СОД в различных образованиях ЦНС при различных способах формирования

экстрапирамидных нарушений (n = 6)

Препарат

Структура

Галоперидол

Галоперидол

+

Кетамин

Стриатум 60,6±5,8 60,0±9,3

Гиппокамп 55,1±6,8 39,6±2,2*

Кора больших полушарий 46,1±4,8 61,0±6,3*

* — P<0,05 ЕД50 галоперидола при сравнении с введением ЕД50 галоперидола + Кетамин

Состояние холинергической системы оценивали по уровню связанного АХ и активности расщепляющего фермента (АХЭ). Установлено, что выраженные двигательные нарушения при введении галоперидола сопровождались значимым снижением уровня связанного АХ и в стриатуме (на 70%), и в гиппокампе (примерно на 50%). Введение блокатора NMDA рецепторов кетамина на фоне действия нейролептика не вызывало изменения уровня АХ в стриатуме, в то время как в гиппокампе было отмечено еще большее снижение содержания АХ (в среднем в два раза по сравнению с действием одного галоперидола). При введении галоперидола наблюдались разнонаправленные изменения активности АХЭ в исследуемых структурах головного мозга. Так, было найдено значимое снижение уровня активности фермента в стриатуме, и напротив, повышение — в гиппокампе. Сочетанное применение обоих препаратов не вызывало значимых изменений его активности.

Обсуждение результатов

Как известно, введение галоперидола, высокоселективного блокатора дофаминовых рецепторов Д2-подтипа, блокируя свыше 70-80% рецепторов, приводит к нарушению двигательной активности по экстрапирамидному типу, что в экспериментальных условиях проявляется в наступлении каталепсии. Модель, полученная при сочетанном введении галоперидола и блокатора NMDA рецепторов кетамина характеризовалась усилением патологической симптоматики. Доза кетамина, используемая в исследовании для формирования модели, сама по себе не обладала выраженным фармакологическим действием. Априори предполагалось, что результатом сочетанной блокады, кроме усиления симптоматики, будут являться однонаправленные изменения параметров, характеризующих механизмы формирования модели.

Однако, на основании полученных данных о состоянии свободно-радикальных процессов (интенсивность перекисного окисления липидов и активность СОД) и о состоянии холинергической системы (по уровню АХ и активности АХЭ) можно сделать вывод о том, что дополнительное усиление патологической симптоматики в результате сочетанной блокады Д2- и NMDA-рецепторов сопровождается принципиальной перестройкой функционирования медиаторных и ферментативных систем мозга.

Литература:

1. Hall E.D.Free radicals in central nervous system injury. // In : Free radical damage and its control. New Comprehensive Biochem. 1994, V.28, P.217-239

2. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. СПб, 2006, 394 с.

3. Практикум по свободнорадикальному окислению (ред Ещенко Н.Д., Маслова М.Н.), СПб, 2006, 107 с.

Комментарии и пинги к записи запрещены.

Комментарии закрыты.

Дизайн: Polepin