Л.Л. Клименко, Л.К. Обухова, А.И. Деев, О.В. Протасова, М.Н. Комарова, В.Ф.Фокин «Системные паттерны функциональной межполушарной асимметрии мышей при нормальном и ускоренном старении» (С.21-31)»

Клименко Л.Л.*, Обухова Л.К.**, Деев А.И.***, Протасова О.В.*, Комарова М.Н.****, Фокин В.Ф.*****

СИСТЕМНЫЕ ПАТТЕРНЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ МЕЖПОЛУШАРНОЙ АСИММЕТРИИ МЫШЕЙ ПРИ НОРМАЛЬНОМ И УСКОРЕННОМ СТАРЕНИИ

*Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва;

**Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва;

***Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, Москва;

****НИИ физико-химической медицины МЗ МП РФ, Москва;

*****Научный центр неврологии РАМН, Москва, Россия

Исследовали возрастую динамику уровня постоянного потенциала в полушариях головного мозга мышей при нормальном и ускоренном старении. Одновременно с помощью метода синхронного сканирования люминесценции определяли концентрацию липофусцина в гомогенатах полушарий головного мозга мышей. Выявлено, что ускорение старения вызывает снижение уровня постоянного потенциала и уменьшение концентрации липофусцина, что можно рассматривать как один из механизмов старения мозга.

Проведен анализ динамики уровня постоянного потенциала и концентрации липофусцина больших полушарий головного мозга мышей при нормальном и ускоренном старении. Ускоренное старение вызывает снижение постоянного потенциала и уменьшение концентрации липофусцина в полушариях головного мозга; межполушарная разность потенциалов, как и межполушарная концентрационная разность липофусцина при ускорении старения претерпевает инверсию, что приводит впоследствии к поведенческой инверсии – «полевению» популяции экспериментальных животных.

Старение мозга проявляется наиболее заметным образом в его интегративной деятельности, существенной компонентой которой является система функциональной межполушарной асимметрии (ФМА), имеющая представительство на разных уровнях биологической организации (поведенческом, нейрофизиологическом, биохимическом, энергетическом и др.) [1, 14]. Известно, что показатели различных уровней ФМА в течение всего периода онтогенеза синхронно претерпевают сложные (немонотонные) изменения, характеризующие процесс старения мозга [6, 7].

Нейрофизиологическим критерием ФМА принято считать уровень постоянного потенциала головного мозга (УПП), т. к. распределение потенциала в полушариях головного мозга определяет тип и выраженность ФМА [4]. Постоянные потенциалы являются нейрофизиологическим показателем стационарной системы управления (в отличие от оперативной, показателем которой является ЭЭГ). В генезе УПП принимают участие в основном сосудистые потенциалы гематоэнцефалического барьера, а также вносят некоторый вклад мембранные потенциалы нейронов и глии [5, 18]. Особенно важно, что генерация мембранных потенциалов связана с энергозатратами, необходимыми для создания и поддержания ионных градиентов, функционирования K-Na насоса и др. Данные экспериментальных исследований свидетельствуют о связи величины постоянного потенциала головного мозга с показателями энергетического обмена: с потреблением кислорода и глюкозы, накоплением гликогена, концентрацией АТФ и других энергетических метаболитов, а также с соотношением окисленных и восстановленных форм дыхательных ферментов NAD-NADH и с интенсивностью реакций свободнорадикального окисления липидов мембран головного мозга [7, 8, 15, 16, 19, 20, 23, 24]. Совокупность этих данных позволяет рассматривать постоянный потенциал как меру интенсивности энергозатратных процессов в головном мозге и делает его удобным инструментом для исследования изменения энергетического метаболизма ЦНС в процессе старения.

Известно, что роль часов старения традиционно приписывается свободнорадикальному окислению [2, 6, 9]. С возрастом собственная флуоресценция многих тканей возрастает (возбуждение при 340-370 нм, испускание при 430-470 нм). Эта флуоресценция называется иначе голубой или нетриптофановой и обычно интерпретируется как накопление пигментов старения – липофусцинов – в тканях. Обычно возрастание данной флуоресценции объясняется образованием шиффовых оснований, т.е. продуктов реакции между аминогруппами и альдегидами. Таким образом, рост собственной голубой флуоресценции тканей является удобным биомаркером старения [8, 17, 21]. В связи с этим исследование возрастной динамики липофусцина в полушариях головного мозга может быть полезным для понимания скорости старения полушарий, а анализ связи между концентрацией липофусцина и УПП в течение всего периода онтогенеза может привести к пониманию возрастных изменений интегративной функции мозга. В проведенных ранее исследованиях нами было показано, что многофазная возрастная динамика УПП синхронизирована с динамикой концентрации липофусцина и других продуктов перекисного окисления липидов головного мозга и описывается М-образной кривой [8]. По такому же типу меняется в головном мозге в процессе онтогенеза активность защитных ферментов – СОД, глутатион-пероксидазы и глутатион-редуктазы [21, 22].

Также нами было выявлено, что концентрация липофусцина, как и других продуктов перекисного окисления липидов, достоверно различается в полушариях головного мозга в течение всего периода онтогенеза, что свидетельствует о различии в скорости старения полушарий [6]. Многофазные возрастные изменения УПП, синхронизированные с изменением концентрации липофусцина, характеризуют процесс нормального (физиологического) старения мозга.

Однако кроме естественного существует и преждевременное старение, вызываемое различными неблагоприятными воздействиями на организм. Общепринятой является модель ускоренного старения, описание которой приведено в работах [3, 10, 25]. При использовании этой модели программа старения реализуется быстрее на 15-20%, чем при нормальном старении, однако структура вариационного ряда продолжительности жизни не меняется: т.е кривые выживания остаются стандартными, они совмещаются в относительных координатах. При ускоренном старении не наблюдается каких- либо патологических соматических повреждений, но в клетках печени и головного мозга возникают дефекты структуры ДНК, опознаваемые нуклеазой S1, характерные для нормального старения [12].

Ранее нами была исследована динамика межполушарной моторной асимметрии при ускоренном старении [11]. Было показано, что у ускоренно стареющих мышей моторная асимметрия отличается от контрольной увеличенным количеством левшей, т.е. при ускорении старения происходит инверсия типа межполушарной асимметрии. Такое «полевение» популяции можно рассматривать как показатель неодинаковой скорости старения полушарий, наиболее отчетливо проявляющейся при ускорении старения. Однако более глубокие причины инверсии ФМА при ускоренном старении до сих пор неясны.

Мы предположили, что исследование изменений показателей нейрофизиологического и биохимического уровней – УПП и липофусцина – может внести ясность в понимание причин инверсии ФМА при нормальном и ускоренном старении.

Целью работы было исследование динамики УПП и липофусцина в полушариях головного мозга мышей разного возраста при нормальном и ускоренном старении.

Методика.

Животные. В работе было использовано 70 мышей-самок линии СВА в возрасте 2, 7, 14 и 26 месяцев. Всего было 5 групп мышей по 10 животных в каждой группе. В возрасте 2 месяца была одна контрольная группа, в возрасте 7 месяцев было две группы контрольных мышей и одна группа – экспериментальных. В возрасте 14 месяцев была одна группа контрольная, другая – с экспериментальными животными и в возрасте 26 месяцев была одна группа с контрольными животными.

Измерение УПП в полушариях головного мозга проводили неинвазивно по описанной ранее методике. Характеристикой типа и выраженности ФМА служила межполушарная разность потенциалов (нейрофизиологический градиент) УПП (d-s) мВ [4, 5]. После окончания острого опыта находящихся под наркозом мышей декапитировали. Концентрацию липофусцина определяли в гомогенатах коры головного мозга с помощью метода синхронного сканирования люминесценции [13]. Интенсивность флуоресценции регистрировали в цилиндрических кварцевых кюветах диаметром 5 мм на спектрофлуориметре Hitahi MPF-4. Параметром, характеризующем накопление липофусцина в полушариях, служилоотношение интенсивности флуоресценции липофусцина (λem=440нм) к интенсивности флуоресценции триптофанила (λem=340 нм). Таким образом, содержание липофусцина нормировалось на содержание белка в пробе.

Модель ускоренного старения. Для создания модели ускоренного радиационного старения мышей подвергали рентгеновскому облучению дозой 7 Гр или, в другом эксперименте, 10 Гр по методу Wheller (1981), в соответствии с которым облучали только голову животного, тело было закрыто стальным экраном толщиной 9 мм. Перед облучением вводили подкожно нембутал в дозе 80 мг/кг массы тела. В зависимости от индивидуальной чувствительности состояние наркоза длилось от 0.5 до 3 часов. Так как глубокий наркотический сон нередко приводит к гибели из-за снижения температуры тела ниже физиологической, после облучения мышей помещали в реанимационную камеру. Животных укладывали на правый бок на деревянную поверхность, подогреваемую до 40°С. Когда мыши просыпались и начинали активно двигаться, их помещали в клетку. Благодаря этим мерам выживали все облученные животные. Для облучения использовали рентгеновскую установку РУТ-200-20-3 мощностью 2.5 Гр/мин.

Статистическая обработка результатов: определение средних значений, сравнительный и корреляционный анализ проводили на IBM PC c помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows 4.11

Результаты и обсуждение.

Анализ средних значений исследованных параметров.

Динамика УПП. В результате проведенной работы было выявлено, что в процессе нормального старения мышей УПП в полушариях головного мозга претерпевает многофазные изменения, близкие по типу к динамике потенциала при нормальном старении крыс (рис. 1, левый график).

Рис. 1. Динамика уровня постоянного потенциала (слева) и концентрации липофусцина (справа) в правом полушарии головного мозга мышей при нормальном (1) и ускоренном (2) старении.

В раннем возрасте (2 мес.) значение УПП максимально, в возрасте 7 и 26 месяцев УПП имеет минимальные значения. Показатели УПП в экспериментальных группах достоверно отличаются от контрольных. Снижение УПП наблюдается как в возрасте 7 месяцев, так и в возрасте 14 месяцев. Особенно сильно это снижение выражено в возрасте 14 месяцев: у в экспериментальных животных УПП снижен в 37, 4 раза. Поскольку УПП можно рассматривать как показатель энергетического метаболизма мозга, этот факт вполне соответствует представлению об энергодефиците позднего возраста.

Межполушарная разность потенциала сохраняется в течение всего периода онтогенеза (рис.2, левый график), однако у ускоренно стареющих животных она радикально отличается от контрольных.

Рис. 2. Динамика межполушарной разности потенциала (слева) и межполушарной разности липофусцина (справа) при нормальном (1) и ускоренном (2) старении.

Особенно сильно это отличие выражено в возрасте 7 месяцев: при ускорении старения межполушарная разность потенциалов УПП (d-s) мВ на 106% больше, чем в контроле! Таким образом, мы наблюдаем инверсию нейрофизиологического межполушарного градиента из отрицательного в положительное значение, иначе говоря, если в контроле у большинства животных в возрасте 7 месяцев доминантным было левое полушарие, определяющее правостороннюю поворотную тенденцию, то после ускорения старения доминантным стало правое полушарие, что привело к показанному ранее «полевению» популяции.

Динамика липофусцина. Динамика концентрации липофусцина в полушариях головного мозга мышей при нормальном старении также синхронизирована с изменением УПП и носит многофазный М-образный характер (рис. 1, правый график). Концентрация ЛФ максимальна в 7 и 26 месяцев и минимальна в 14 месяцев. Межполушарная разность концентрации липофусцина – биохимический градиент – также сохраняется в течение всего периода онтогенеза, при этом концентрация ЛФ в правом, субдоминантном для большинства животных, полушарии остается выше, чем в левом, почти во всех возрастных группах, кроме группы двухмесячных мышей (рис 2, правый график). Этот результат подтверждает сделанные ранее выводы о том, что накопление ЛФ – немонотонная функция возраста и различная концентрация его в полушариях свидетельствует о различии в скорости старения полушарий. Поскольку ЛФ является внутриклеточным депо кислорода [17], его накопление и утилизация в процессе онтогенеза может рассматриваться как приспособление к гипоксии в молодом и старческом возрасте. ЛФ – это маркер не только хронологического, но и функционального возраста и представляет собой одну из адаптивных метаболических систем. Очевидно, что изменение его концентрации в онтогенезе отражает возрастные изменения функционального состояния и энергозатрат головного мозга. Известно, что в процессе онтогенеза существует ряд критических моментов, связанных с созреванием мозга, когда значительно меняется его деятельность. Эти моменты соответствуют основным периодам жизни: достижению половой зрелости, репродуктивному периоду и периоду угасания репродуктивной функции [14]. С ними совпадают изменения в активности защитных ферментных систем, под контролем которых протекают процессы ПОЛ. Кривые возрастных изменений активности ферментов ткани мозга (СОД и системы глутатионовых ферментов) также имеют М-образный характер и переломные моменты кривых динамики активности ферментов совпадают по времени с переломными моментами на представленных графиках. Таким образом, динамика концентрации ЛФ в полушариях оказывается сбалансированной с активностью ферментов антиоксидантной защиты.

С другой стороны, УПП, как мембранозависимый феномен, уменьшается при снижении сопротивления мембран нервных и глиальных клеток, (увеличении проницаемости мембран) сопровождающим процессы ПОЛ.

Сходство динамики УПП с динамикой активности защитных ферментов позволяет утверждать, что все исследованные процессы являются составными частями единой адаптивной системы.

Концентрация ЛФ в полушариях головного мозга ускоренно стареющих мышей снижается в два раза в возрастной группе 7 месяцев. В то же время у экспериментальных животных в 14 месяцев концентрация ЛФ не отличается от контроля. Таким образом, на примере ЛФ можно наблюдать возрастные различия скорости старения полушарий головного мозга. Можно предположить, что уменьшение концентрации ЛФ у экспериментальных животных в возрасте 7 месяцев связано с высокой антиоксидантной активностью ферментов, характерной для этого возраста.

Как видно из рисунка 2, межполушарная разность концентрации ЛФ (d-s) в возрасте 7 месяцев у экспериментальных животных снижается, переходя в отрицательное значение, таким образом, наблюдается инверсия биохимического концентрационного межполушарного градиента, так же, как и нейрофизиологического, т.е. межполушарной разности потенциалов. Можно предположить, что это изменение также может лежать в основе поведенческой инверсии, т.е. в основе «полевения» популяции животных после применения модели ускоренного старения.

Корреляционный анализ

С помощью корреляционного анализа в контрольных группах разного возраста были выявлены достоверные корреляционные связи между УПП и ЛФ, подтверждающие положение о единой многоуровневой системе межполушарной асимметрии (таблица 1). Однако в экспериментальных группах животных корреляционные связи между показателями нейрофизиологического и биохимического уровней отсутствуют: ускорение старения приводит к разрыву связей, т. е. нарушению согласованности между уровнями ФМА, что ассоциируется с возрастным нарушением интегративной деятельности мозга.

Итак, в результате проведенного исследования было показано, что:

• многофазная возрастная динамика уровня постоянного потенциала синхронизирована с многофазной динамикой липофусцина.

• ускорение старения вызывает снижение постоянного потенциала, что ассоциируется с возникновением возрастного энергодефицита в ЦНС;

• ускорение старения вызывает также уменьшение концентрации липофусцина в полушариях головного мозга;

• межполушарная разность потенциалов, как и межполушарная концентрационная разность липофусцина при ускорении старения претерпевает инверсию, что приводит впоследствии к поведенческой инверсии – «полевению» популяции экспериментальных животных.

Литература

1. Адрианов О.С. О принципах организации интегративной деятельности мозга. М.:Медицина, 1976. 279 с.

2. Анисимов В.Н. // Природа. – 1995 – №10. – С. 3-12.

3. Акифьев А.П., Обухова Л.К., Измайлов Д.М. // Вестник РАН. – 1992. – №5. – С. 82-92

4. Клименко Л.Л. // Биофизика. – 1987б. – Т.32. – №4. – С. 691.

5. Клименко Л.Л., Деев А.И., Фокин В.Ф. // Биофизика. – 1987а. – Т. 32. – №4. С. – 691.

6. Клименко Л.Л., Деев А.И., Протасова О.В., Фокин В.Ф., Пирузян Л.А. // Биофизика. – 1998. – Т. 43. – В. 6. – С. 1063-1065.

Комментарии и пинги к записи запрещены.

Комментарии закрыты.

Дизайн: Polepin