И.П. Григорьев, Е.Г. Гилерович, О.В. Кирик, Т.Д. Власов, Д.Э. Коржевский «РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЙРОГЛОБИНА В СТРУКТУРАХ ПЕРЕДНЕГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ ТРАНЗИТОРНОЙ ИШЕМИИ» (С. 15-21)

И.П. Григорьев *, Е.Г. Гилерович *, О.В. Кирик *, Т.Д. Власов **, Д.Э. Коржевский *
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЙРОГЛОБИНА В СТРУКТУРАХ ПЕРЕДНЕГО МОЗГП КРЫС ПОСЛЕ ТРАНЗИТОРНОЙ ИШЕМИИ
*ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия,
** Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия;
* Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russia;
** Pavlov State Medical University, St. Petersburg, Russia

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЙРОГЛОБИНА В СТРУКТУРАХ ПЕРЕДНЕГО МОЗГП КРЫС ПОСЛЕ ТРАНЗИТОРНОЙ ИШЕМИИ
И.П. Григорьев, Е.Г. Гилерович, О.В. Кирик, Т.Д. Власов, Д.Э. Коржевский
В работе иммуногистохимически исследовано распределение гем-содержащего белка нейроглобина в переднем мозге крыс в норме и через 48 час после транзиторной ишемии, вызванной эндоваскулярной окклюзией средней мозговой артерии в течение 30 мин. Выявлено неравномерное распределение нейроглобина в структурах переднего мозга: наивысшая интенсивность нейроглобиновой иммунореактивности наблюдалась в коре мозга, хвостатом ядре, поверхностных ядрах перегородки, сосудистом сплетении и эпендимной выстилке латерального желудочка. Менее всего нейроглобина выявлялось в проводящих путях. Односторонняя ишемия мозга ведёт к значительному снижению нейроглобиновой иммунореактивности в повреждённом полушарии – в полосатом теле и неокортексе. Не было обнаружено увеличения экспрессии нейроглобина в пограничной зоне повреждения или в отдалении от него.
Ключевые слова: головной мозг, нейроглобин, иммуногистохимия, ишемия.
DISTRIBUTION OF NEUROGLOBIN IN RAT FOREBRAIN STRUCTURES AFTER TRANSITORY ISCHAEMIA
I.P. Grigorev, E.G. Gilerovich, O.V. Kirik, T.D. Vlasov, D.E. Korzhevskii
The distribution of the heme-containing protein, neuroglobin, in the rat forebrain was examined using immunohistochemistry in normal rats and in rats 48 h after transitory ischaemia induced by endovascular occlusion of the middle cerebral artery for 30 min. In rats with transitory ischaemia, an uneven distribution of neuroglobin was observed in the forebrain: maximal neuroglobin immunoreactivity was found in the cortex, caudate nucleus, choroid plexus, and ependymal lining, whereas the least neuroglobin immunoreactivity occurred in neural pathways. Unilateral brain ischaemia results in a profound decrease in neuroglobin immunoreactivity in the lesioned hemisphere. No increased expression of neuroglobin was detected in the penumbra or at points located distal from the lesioned site.
Key words: brain, neuroglobin, immunohistochemistry, ischaemia.

Введение. Нейроглобины – гем-содержащие белки, относящиеся к обширной группе гемоглобиновых белков, были обнаружены в 2000 г. в мозге млекопитающих, включая человека [Burmester et al., 2000]. Нейроглобин обратимо и с высоким сродством связывает кислород гемовым железом [Burmester et al., 2000], на основании чего было предположено, что нейроглобин, подобно прочим глобиновым белкам, служит для транспорта и хранения кислорода в мозге. Однако, хотя нейроглобин обнаружен только в нервных клетках центральной и периферической нервной системы и эндокринных органах [Burmester et al., 2000; Laufs et al., 2004], концентрация его в головном мозге оказалась невысокой [Dewilde et al., 2001], что ставит под сомнение данную гипотезу. По альтернативному предположению возможна роль нейроглобина как «чистильщика» радикалов кислорода и окиси азота [Fordel et al., 2007], благодаря чему нейроглобин обладает нейропротективными свойствами [Khan et al., 2006; Sun et al., 2001; Sun et al., 2003]. Однако нейропротективные свойства нейроглобина при ишемии мозга не были подтверждены другими авторами [Hundahl et al., 2006]. Высокая частота ишемических заболеваний мозга, ведущая к инвалидизации [Lo et al., 2003], является серьёзной медицинской проблемой, которая привела к созданию специального направления науки, в рамках которого проводятся многочисленные исследования механизмов патологических изменений, вызванных гипоксией мозга разного генеза, и способов борьбы с ними [Григорьев и соавт., 2012; Дьяконов, Шабанов, 2011; Евсеева и соавт., 2008; Зарубина и соавт., 2012; Иванов, 2012; Кирик О.В. и соавт., 2012; Коржевский и соавт., 2004, 2012, 2013; Кратирова и соавт., 2012; Медникова и соавт., 2012; Михеев и соавт, 2011; Отеллин и соавт., 2003, 2004; Candelario-Jalil, 2009; Ginsberg, 2009; Dirnagl, 2012; Moskowitz et al., 2010; Prabhakaran, Naidech, 2012; Spuy W.J., van der, Pretorius E., 2012; Thurman et al., 2012; Xing et al., 2012]. В рамках данного научного направления изучение функции нейроглобина в нервной системе вообще и особенно его возможное протективное действие при нарушении мозгового кровообращения имеет важное значение. В настоящей работе мы исследовали распределение и состояние нейроглобин-содержащих структур переднего мозга крысы после экспериментальной ишемии мозга.

Материалы и методы. Исследование проведено на половозрелых крысах-самцах Вистар (n=15). Ишемию вызывали путём эндоваскулярной окклюзии средней мозговой артерии под общей анестезией. Продолжительность нарушения кровообращения в бассейне левой средней мозговой артерии составляла 30 мин, время реперфузии 48 ч. Ишемизированное полушарие сравнивали с контрлатеральным, а также мозгом интактных крыс. Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.1977г. МЗ СССР). Мозг животных фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [Коржевский и соавт., 2006], заливали в парафин и изготавливали фронтальные серийные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия). Нейроглобин выявляли на срезах с помощью иммуногистохимической реакции с применением поликлональных кроличьих антител (N7162, Sigma, США). После постановки иммуногистохимических реакций часть гистологических препаратов подкрашивали гематоксилином и анализировали с помощью микроскопов Leica DM 2500 (Leica, Германия). Идентификацию структур мозга проводили по атласу [Paxinos, Watson, 1986].

Результаты и их обсуждение. Исследование мозга интактных крыс обнаружило неравномерное распределение нейроглобина. Наивысшая интенсивность иммунореактивности наблюдалась в коре мозга, особенно в её поверхностных слоях, а в цингулярной, инсулярной и пириформной коре – во всех слоях. Высокая интенсивность окрашивания наблюдалась в хвостатом ядре за исключением пучков проводящих волокон, в поверхностных ядрах перегородки, в сосудистом сплетении и эпендимной выстилке латерального желудочка, в аркуатном и медиальном преоптическом ядрах гипоталамуса. Значительно слабее была иммунореактивность в каудальных отделах бледного шара, в дорсальной перегородке и дорсальной части латерального перегородочного ядра, каудальных отделах перегородки (треугольное ядро), субфорникальном органе. Наиболее низкой иммунореактивность была в проводящих путях: мозолистом теле, поясе, белом веществе хвостатого ядра, передней комиссуре, латеральном обонятельном тракте.

При реакции на нейроглобин в нейронах преимущественно окрашивалась цитоплазма, ядро было слабо иммунопозитивным. На этом фоне более отчетливо выделялась реакция в ядрышке.

В эксперименте, в случаях наиболее сильного ишемического поражения наблюдаются выраженные дегенеративные изменения в поражённом полушарии с резким уменьшением нейроглобиновой иммунореактивности почти во всём полушарии за исключением цингулярной и прилежащего участка фронтальной коры, перегородки и базальных отделов переднего мозга. При меньшем объеме ишемического повреждения значительное снижение интенсивности нейроглобиновой иммунореактивности отмечается в хвостатом ядре за исключением его перивентрикулярного отдела и ядре ложа конечной полоски, особенно его постеромедиальной части. Некоторое снижение нейроглобиновой иммунореактивности наблюдается также в первичной соматосенсорной коре. Изучение пограничной зоны повреждения (пенумбра) в сравнении с симметричной областью контрлатерального полушария не выявило увеличения интенсивности нейроглобиновой иммунореактивности под действием ишемического повреждения.

В ходе проведённого исследования были получены данные о неравномерном распределении нейроглобина в переднем мозге крысы (рис.). Полученные результаты в целом совпадают с данными [Mammen et al., 2002].

Рисунок. Ишемический инсульт. Поражение коры и в меньшей степени хвостатого ядра. Слева – поражённое, справа – контрлатеральное полушарие. Интенсивная окраска хвостатого ядра, эпендимной выстилки латерального желудочка, сосудистого сплетения, сенсомоторной коры. Иммуногистохимическая окраска на нейроглобин без подкраски.

Было установлено, что 30-минутная односторонняя ишемия мозга ведёт через 2 суток к значительному снижению нейроглобиновой иммунореактивности в повреждённом полушарии – в полосатом теле, а также – в случае инфаркта – в неокортексе, что свидетельствует о дегенерации нервных клеток, содержащих нейроглобин. Нейроглобин, содержащийся в стриатных и кортикальных нейронах, не может предотвратить гибель нервных клеток, хотя, возможно, способствует их выживаемости, что было продемонстрировано в культуре клеток [Sun et al., 2001]. Зона повреждения у трансгенных мышей, экспрессирующих избыток нейроглобина, у которых вызывали унилатеральную ишемию мозга, была через 1 и 14 суток меньше в коре мозга, чем у мышей дикого типа, однако объём повреждения в подкорковых областях и поведенческие нарушения у таких мышей были на уровне контроля [Wang et al., 2008]. На основании этих литературных данных можно было предположить, что синтез нейроглобина будет усиливаться для защиты нервной ткани от ишемического повреждения. Однако в нашем исследовании не удалось обнаружить увеличения экспрессии нейроглобина в пограничной зоне повреждения или в отдалении от него. Это может быть связано с тем, что производство нейроглобина может реально не увеличиваться в ответ на экспериментально вызванную ишемию, хотя не исключено, что увеличение его синтеза происходит в те временные периоды после ишемии, которые не совпадают с избранным нами сроком изучения мозга после ишемии.

Помимо этого, отсутствие видимого изменения в состоянии нейроглобин-содержащих клеток может быть связано с недооценкой возможной межполушарной асимметрии в устойчивости к гипоксии, которая была продемонстрирована на мышах [Михеев и соавт., 2011]. Исходя из этого, нельзя исключать, что и у крыс степень ишемического повреждения и выраженность возможных изменений в нейроглобиновой системе может зависеть от того, в каком полушарии производилась окклюзия средней мозговой артерии. Учёт этого фактора может оказаться полезным в дальнейших исследованиях для более отчётливого выявления возможных эффектов ишемического повреждения мозга на нейроглобиновую систему.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 11-04-01693а, 10-04-00180а).

Список литературы

  1. Григорьев И. П., Гилерович Е. Г., Петрова Е. С. и соавт. Катехоламинергические структуры переднего мозга крыс после транзиторной ишемии // Регион. кровообращ. микроциркул. – 2012. – № 2(42). – C. 57-60.
  2. Дьяконов М.М., Шабанов П.Д. К вопросу о нейропротекторном действии пептидных препаратов // Вест. Росс. военно-мед. акад. – 2011. – Т. 1. – С. 255-258.
  3. Евсеева М.А., Евсеев А.В., Правдивцев В.А., Шабанов П.Д. Механизмы развития острой гипоксии и пути ее фармакологической коррекции // Обзоры клин. фармакол. лекарств. терап. – 2008. – Т. 6. – № 1. – С. 3-25.
  4. Зарубина И.В., Лукк М.В., Шабанов П.Д. Антигипоксические и антиоксидантные эффекты экзогенной янтарной кислоты и аминотиоловых сукцинатсодержащих антигипоксантов // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2012. – Т. 153. – № 3. – С. 313-317.
  5. Иванов К.П. Гипоксия мозга и роль активных форм кислорода и недостатка энергии в дегенерации нейронов // Усп. физиол. наук. – 2012. – Т. 43. – № 1. – С. 95-110.
  6. Кирик О.В., Власов Т.Д., Коржевский Д.Э. Маркеры нейральных стволовых клеток нестин и musashi-1 в клетках конечного мозга крысы после транзиторной фокальной ишемии // Морфология. – 2012. – Т. 142. – № 4. – С. 19-24.
  7. Коржевский Д.Э., Григорьев И.П., Отеллин В.А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006. – Т. 129. – №1. – С. 85-86.
  8. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Власов Т.Д. Появление звездчатых гладких миоцитов в головном мозгу крысы после транзиторной фокальной ишемии // Морфология. – 2013. – Т. 143. – № 1. – С. 73-75.
  9. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Власов Т.Д. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии // Морфология. – 2012. – Т. 141. – № 2. – С. 28-32.
  10. Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П. и соавт. Структурная организация астроцитов гиппокампа крысы в постишемический период // Морфология. – 2004. Т. 125. – № 2. – С. 19-21.
  11. Кратирова Н.В., Веселкина О.С., Колпакова М.Э. и соавт. Эффект внутригастрального введения креатинилглицин этилового эфира фумарата при окклюзионной ишемии мозга у крыс // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2012. – Т. 98. – № 10. – С. 1258-1263.
  12. Медникова Ю.С., Кожечкин С.Н., Копытова Ф.В., Коштоянц О.Х. Приспособительная функция мозга и проблемы гипоксии // Патол. физиол. экспер. терап. – 2012. – № 3. – С. 33-41.
  13. Михеев В.В., Марышева В.В., Шабанов П.Д. Влияние амтизола на межполушарную асимметрию головного мозга мышей линии SHR при гиперкапнической гипоксии // Асимметрия. – 2011. – Т. 5. – № 3. – С. 23-34.
  14. Отеллин В.А., Гилерович Е.Г., Хожай Л.И. и соавт. Последствия пренатального воздействия гипоксии на развивающийся мозг // Мед. акад. журн. – 2004. – Т. 4. – № 4. – С. 38-45.
  15. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Гилерович Е.Г. и соавт. Клеточные и тканевые реакции эмбрионального головного мозга животных на гипоксию // Доклады РАН. – 2003. – Т. 393. – № 5. – С. 1-3.
  16. Burmester, T., Weich, B., Reinhardt, S., Hankeln, T. A vertebrate globin expressed in the brain // Nature. – 2000. – V. 407. – P. 520–523.
  17. Candelario-Jalil E. Injury and repair mechanisms in ischemic stroke: considerations for the development of novel neurotherapeutics // Curr. Opin. Investig. Drugs. – 2009. V. 10. – P. 644–654.
  18. Dewilde, S., Kiger, L., Burmester, T. et al. Biochemical characterization and ligand binding properties of neuroglobin, a novel member of the globin family // J. Biol. Chem. – 2001. – V. 276. – P. 38949–38955.
  19. Dirnagl U. Pathobiology of injury after stroke: the neurovascular unit and beyond // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2012. – V. 1268. – P. 21-25.
  20. Fordel E., Thijs L., Moens L., Dewilde S. Neuroglobin and cytoglobin expression in mice. Evidence for a correlation with reactive oxygen species scavenging // FEBS J. – 2007. – V. 274. – P. 1312–1317.
  21. Ginsberg M.D. Current status of neuroprotection for cerebral ischemia: synoptic overview // Stroke. – 2009. – V. 40. – P. S111–114.
  22. Hundahl C., Kelsen J., Kjaer K. et al. Does neuroglobin protect neurons from ischemic insult? A quantitative investigation of neuroglobin expression following transient MCAO in spontaneously hypertensive rats // Brain Res. – 2006. – V. 1085. – №1. – P. 19-27.
  23. Khan A.A., Wang Y., Sun Y. et al. Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – V. 103. – P. 17944–17948.
  24. Laufs T.L., Wystub S., Reuss S. et al. Neuron-specific expression of neuroglobin in mammals // Neurosci. Lett. – 2004. – V. 362. – P. 83-86.
  25. Lo E.H., Dalkara T., Moskowitz M.A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke // Nat. Rev. Neurosci. – 2003. V. 4. – P. 399–415.
  26. Mammen P.P., Shelton J.M., Goetsch S.C. et al. Neuroglobin, a novel member of the globin family, is expressed in focal regions of the brain // J. Histochem. Cytochem. – 2002. – V. 50. – №12. – Р. 1591-1598.
  27. Moskowitz M.A., Lo E.H., Iadecola C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments // Neuron. – 2010. – V. 67. – P. 181–198.
  28. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 1986, San Diego: Academic Press.
  29. Prabhakaran S, Naidech AM. Ischemic brain injury after intracerebral hemorrhage: a critical review // Stroke. – 2012. – V. 43. – N 8. – P. 2258-2263.
  30. Spuy W.J., van der, Pretorius E. Interrelation between inflammation, thrombosis, and neuroprotection in cerebral ischemia // Rev, Neurosci. – 2012. – V. 23. – N 3. – C. 269-278.
  31. Sun Y., Jin K., Mao X.O. et al. Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – V. 98. – P. 15306–15311.
  32. Sun Y., Jin K., Peel A. et al. Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – V. 100. – P. 3497–3500.
  33. Thurman R.J., Jauch E.C., Panagos P.D. et al. Four evolving strategies in the emergent treatment of acute ischemic stroke // Emerg. Med. Pract. – 2012. – V. 14. – N 7. – P. 1-26.
  34. Wang X., Liu J., Zhu H. et al. Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long-term outcomes after focal cerebral ischemia // Stroke. – 2008. – V. 39. – №6. – Р. 1869-1874.
  35. Xing C., Arai K., Lo E.H., Hommel M. Pathophysiologic cascades in ischemic stroke // Int. J. Stroke. – 2012. – V. 7. – P. 378-385.


Комментарии и пинги к записи запрещены.

Комментарии закрыты.

Дизайн: Polepin