Е.С. Петрова, Т.Д. Власов, Е.А. Колос, Д.Э. Коржевский «ГАМК-ергические нейроны стриатума крыс в норме и при ишемическом повреждении» (С. 4-9)

Е.С. Петрова*, Т.Д. Власов**, Е.А. Колос*, Д.Э. Коржевский*

ГАМК-ЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ СТРИАТУМА КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ

*ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия

**Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия

ГАМК-ЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ СТРИАТУМА КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИЕ.С. Петрова, Т.Д. Власов, Е.А. Колос, Д.Э. КоржевскийГамма-аминомасляная кислота (ГАМК) — один из главных ингибиторных нейротрансмиттеров в ЦНС, синтезируется в нервных клетках из глутаминовой кислоты при участии фермента глутамат-декарбоксилазы (GAD). Его изоформа GAD-67 служит маркером ГАМК-ергических нейронов. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений в распределении GAD-67-иммунопозитивных нейронов в стриатуме крыс в условиях эксперимента, воспроизводящего кратковременную фокальную ишемию головного мозга. Производили эндоваскулярную окклюзию левой средней мозговой артерии крыс. Продолжительность нарушения кровообращения составляла 30 мин, время реперфузии – 48 ч. С помощью количественного анализа GAD-67-иммунопозитивных нейронов стриатума установлено, что число ГАМК-ергических нейронов стриатума ипсилатерального полушария уменьшается на 40%. В контралатеральном полушарии распределение и структура нейронов не отличается от контроля. ГАМК-ергические нейроны оказываются менее чувствительными к повреждению, по сравнению с нейронами других фенотипов.Ключевые слова: стриатум, глутамат-декарбоксилаза, ГАМК-ергические нейроны, ишемия.
GABA-ERGIC NEURONS IN THE RAT STRIATUM UNDER NORMAL AND ISCHEMIC INJURY
E.S. Petrova, T.D. Vlasov, E.A. Kolos, D.E. Korzhevsky
Gamma-aminobutyric acid (GABA) is a major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. Enzyme glutamate decarboxylase (GAD-67) is a marker of GABA-ergic neurons. The purpose of this study is to examine the distribution of GAD-67-immunopositive neurons in the striatum of rats under experimental conditions, reproducing brief focal cerebral ischemia. Endovascular occlusion of the left middle cerebral artery in rats was performed. Duration of circulatory disorders was 30 min, the time of reperfusion was 48 hours. With counting GAD-67-immunopositive neurons in the striatum was found that the number of GABA-ergic neurons in the striatum ipsilateral hemisphere is reduced by 40%. In the contralateral hemisphere, the distribution and structure of the neurons is not different from controls. It is shown that GABA-ergic neurons are less susceptible to damage, as compared to other neurons phenotypes.
Key words: striatum, glutamate decarboxylase, GABA-ergic neurons, ischemia.


Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является одним из главных ингибиторных нейротрансмиттеров в ЦНС. ГАМК-ергические нейроны локализуются во многих структурах мозга: гиппокампе, стриатуме, неокортексе, мозжечке, обонятельной луковице и др. ГАМК синтезируется в клетке из глутаминовой кислоты при участии особой формы декарбоксилазы [8]. Глутамат-декарбоксилаза (GAD) широко используется как маркер ГАМК-ергических нейронов, поскольку имеет более крупную молекулу, чем молекула гамма-аминомасляной кислоты и хорошо сохраняется при фиксации. Показано, что изоформа GAD с молекулярным весом 67 kDa (GAD-67) содержится в телах, дендритах и аксонных терминалях нервных клеток [4, 12]. Известно, что ГАМК играет важную роль в регуляции мозгового кровообращения и оказывает сосудорасширяющее действие [3]. Учитывая значение ГАМК в регуляции тонуса сосудов мозга, представляется важным изучить происходящие в ГАМК-ергической системы мозга изменения при гипоксии и ишемии. Цель настоящего исследования – изучить изменения в распределении GAD-67-иммунопозитивных нейронов в стриатуме крыс в условиях эксперимента, воспроизводящего кратковременную фокальную ишемию головного мозга.
Материал и методы. В работе использованы крысы-самцы Вистар (n=11). Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ №755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Производили эндоваскулярную окклюзию средней мозговой артерии (СМА) под общей анастезией (тиопентал-натрий, 60 мг/кг). Продолжительность нарушения кровообращения в бассейне левой СМА составляла 30 мин, время реперфузии – 48 ч. Контролем служил мозг интактных крыс. Животных умерщвляли парами этилового эфира. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [1]. Иммуногистохимическую реакцию ставили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм. Для выявления GAD-67 использовали поликлональные кроличьи антитела (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов для GAD-67 использовали реактивы из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection Kit HRP/Dab (Bio Genex, США).Количественный анализ проводили на цифровых изображениях, полученных при помощи микроскопа Leica DM 750 и цифровой камеры Leica ICC 50. Подсчитывали число GAD-67- иммунопозитивных нейронов стриатума на площади 2,56 мм² с пересчетом на 1 мм². Для подсчета использовали программу ImageJ (NIH, США). О значении различий судили по величине t-критерия.
Результаты исследования. Иммуногистохимическое исследование интактного мозга крыс показало, что нейроны, содержащие GAD-67, выявляются в области стриатума и представляют собой клетки различных размеров и формы (рис.1, а).
Petrova_1_2013_1
Рис.1. Общий вид стриатума крысы в норме (а) и при ишемии (б). Иммуногистохимическая реакция на GAD-67. Масштаб: 100 мкм.
Petrova_1_2013_2
Рис.2. GAD-67-иммунопозитивные нейроны стриатума крыс в норме. Масштаб: 10 мкм.
Иногда выявляются их тонкие отростки, которые можно проследить на расстоянии до 37 мкм. Нейроны достигают размеров 9х18 – 10х20 мкм². Они имеют темную гомогенно окрашенную цитоплазму и светлые неокрашенные ядра. В нейропиле можно видеть большое число синаптических ГАМК-ергических бутонов. Иммуногистохимическое исследование стриатума крыс после ишемии показало, что в ипсилатеральном полушарии число GAD-67-иммунопозитивных нейронов снижается по сравнению с контролем приблизительно на 40 % (таблица) (рис.1,б). Сохранившиеся нейроны подвергаются дистрофическим изменениям (рис.3). Их цитоплазма не гомогенно окрашена, как наблюдается в контроле, а содержит глыбчатые структуры. Ядра практически не просматриваются и выглядят сморщенными. В нейропиле плотность GAD-67-содержащих синапсов снижается. В контралатеральном полушарии таких изменений не обнаружено.
Таблица. Изменение числа GAD-67-содержащих нейрнов в стриатуме крыс через 48 ч после ишемического повреждения
Контроль (n=4) Опыт (n=7)
Стриатум интактных крыс Стриатум ипсилатерльногополушария Стриатум контра- латерального полушария
28,35 ± 4,07 16,17 ± 2,58* 30,31 ± 4,30

*р < 0,05

Petrova_1_2013_3
Рис.3. GAD-67-иммунопозитивные нейроны в ипсилатеральном полушарии крысы после ишемического повреждения. Масштаб: 10 мкм.


Обсуждение. О чувствительности ГАМК-ергических нейронов к повреждению в литературе нет единого мнения. В отдельных работах сообщается, что ГАМК-ергичесике нейроны более чувствительны к повреждениям мозга, чем нервные клетки других фенотипов. Это показано для ГАМК-ергических нейронов неокортекса в экспериментах с гипоксией и деафферентацией [5, 9], а также в исследованиях in vitro [11]. Другие исследователи обнаружили, что ГАМК-ергические нейроны обладают резистентностью к повреждению мозга. Это было продемонстрровано на моделях экспериментального инсульта для нейронов гиппокампа и неокортекса [6, 10]. Третье мнение принадлежит Li Y. с соавт. (2010) [7], которые считают, что разные популяции ГАМК-ергических клеток по-разному реагируют на повреждение. Используя иммуногистохимические реакции на GAD-65 и GAD-67, авторы показали, что через 1 и 3 сут после 20-минутной транзиторной ишемии в дорсолатеральной области стриатума крыс количество ГАМК-ергических нейронов возрастает почти в 3 раза. По данным настоящего исследования в стриатуме ипсилатерального полушария через 48 ч после окклюзии СМА наблюдается существенное уменьшение ГАМК-ергических нейронов. Сохранившиеся нейроны хотя и претерпевают дистрофические изменения, но легко идентифицируются в мозге благодаря интенсивной реакции на GAD-67. Необходимо отметить, что ранее проведенные исследования с использованием данной модели ишемии показали, что большинство клеток стриатума, экспрессирующих маркер нейронов NeuN, дегенерируют через 48 ч после ишемии [2]. Следовательно, по сравнению с другими нейронами стриатума, GAD-67-содержащие клетки относительно более устойчивы в условиях транзиторной фокальной ишемии.Таким образом, полученные данные свидетельствуют о неодинаковой чувствительности нейронов полосатого тела головного мозга к повреждению, обусловленному преходящими нарушениями мозгового кровообращения, что может иметь важное значение при изучении механизмов развития и способов предупреждения постишемической энцефалопатии.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты 11-04-01693а, 10-04-00180а).

Список литературы.
  1. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г., Гилерович Е.Г., Петрова Е.С., Кирик О.В.,Григорьев И.П. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммунноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии// Морфология. — 2013. — Т.143.- №2.- С. 81-85.
  2. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Байса А.Е., Власов Т.Д. Моделирование одностороннего ишемического повреждения нейронов стриатума с помощью непродолжительной окклюзии средней мозговой артерии// Бюллетень экспер.биологии и медицины. — 2009. — Т. 147. — №2. — С.217-219.
  3. Мирзоян С.А. Нейрохимический контроль мозгового кровообращения// Фармакол. Токсикол. — 1983. — Т.46. — № 4. — С. 5-15.
  4. Esclapez M., Tillakaratne N.J., Kaufman D.L. et al. Comparative localization of two forms of glutamic acid decarboxylase and their mRNAs in rat brain supports the concept of functional differences between the forms// J. Neurosci. — 1994. — V.14. — № 2. — P.1834-1855.
  5. Gierdalski M., Jablonska B., Smith A. et al. Deafferentation induced changes in GAD67 and GluR2 mRNA expression in mouse somatosensory cortex// Brain Res. Mol Brain Res. — 1999. — V.71. — №1. — P.111-119.
  6. Johansen FF. Interneurons in rat hippocampus after cerebral ischemia. Morphometric, functional, and therapeutic investigations// Acta Neurol.Scand. Suppl. — 1993. — V.150. — P.1-32.
  7. Li Y., Blanco G.D., Lei Z., Xu Z.C. Increased GAD expression in the striatum after transient cerebral ischemia// Mol. Cell. Neurosci. — 2010. — V. 45. — №4. — P. 370-377.
  8. Roberts E, Frankel S. Gamma-aminobutyric acid in brain: its formation from glutamic acid// J. Biol. Chem. — 1950. — V. 187. — №1. — P. 55-63.
  9. Sloper J.J., Johnson P., Powell T.P. Selective degeneration of interneurons in the motor cortex of infant monkeys following controlled hypoxia: a possible cause of epilepsy// Brain Res. — 1980. — V.198. — №1. — P. 204-209.
  10. Tecoma E.S., Choi D.W. GABAergic neocortical neurons are resistant to NMDA receptor-mediated injury// Neurology. — 1989. — V. 39. — №5. — P. 676-682.
  11. Weiss J.H., Koh J., Baimbridge K.G., Choi D.W. Cortical neurons containing somatostatin- or parvalbumin-like immunoreactivity are atypically vulnerable to excitotoxic injury in vitro// Neurology. — 1990. — V.40. — №8. — P. 1288-1292.
  12. Wu J.Y., Matsuda T., Roberts E. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from mouse brain// J. Biol. Chem. — 1973. — V. 248. — №9. — P. 3029-3034.

 

Комментарии и пинги к записи запрещены.

Комментарии закрыты.

Дизайн: Polepin