А.В. Швецов, Н.Г. Лопатина «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЛАТЕРАЛИЗАЦИИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA L.» (С. 18-25)

А.В. Швецов, Н.Г. Лопатина

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЛАТЕРАЛИЗАЦИИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA L.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия

Pavlov Institute of Physiology Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, Russia

 

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЛАТЕРАЛИЗАЦИИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ У МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA L.
А.В. Швецов, Н.Г. Лопатина
Проведено иммуногистохимическое исследование статуса метилирования гистона Н3 по лизину 4 в мозге медоносной пчелы в разные сроки после сеанса ассоциативного обучения. Было показано, что уровень метилирования Н3К4 в нейронах грибовидных тел пчел опытной группы после выработки условного рефлекса на запах был достоверно выше, чем в контрольной группе через 1,6 и через 24 часа. При этом процесс изменения уровня Н3К4 в нейронах грибовидных тел разных полушариях идет неравномерно — количество иммунопозитивных ядер нейронов в каликсах правой гемисферы в опыте было достоверно выше, чем в левом.
Ключевые слова: латерализация, медоносная пчела, грибовидные тела, ассоциативное обучение, метилирование гистона H3.
 
 
MOLECULAR GENETIC BASIS OF LONG-TERM MEMORY LATERALIZATION IN THE HONEYBEE APIS MELLIFERA L.
A.V. Shvetsov, N.G. Lopatina
Immunohistochemical research of histone H3 methylation on lysine 4 status in the honeybee brain at various intervals after conditioning has been conducted. It has been shown that the bees trained in a proboscis extension reflex paradigm had elevated level of H3K4me in neurons of mushroom bodies 1, 6 and 24 hours after conditioning trials. In addition, changing of the level of H3K4me in neurons of mushroom bodies is represented unequally in different hemispheres — the number of immunopositive neurons in calyxes of the right hemisphere was significantly higher than in the left.
Key words: lateralization, honeybee, mushroom bodies, associative learning, histone H3 methylation
 
http://dx.doi.org/10.18454/ASY.2015.34.733

Введение.

Известно, что функциональная и анатомическая асимметрия мозга представляет собой широко распространенный феномен, свойственный не только человеку, но и ряду видов, как позвоночных, так и беспозвоночных животных. К настоящему моменту времени межполушарная латерализация, как основа нормального функционирования мозга, описана практически для всех классов позвоночных животных, а также для ракообразных, нематод, насекомых и моллюсков (cм.обзоры Бианки, 1989, Бианки, Филиппова, 1997, Frasnelli, Vallortigara, Rogers, 2012).

Среди беспозвоночных животных, наиболее перспективным объектом для изучения молекулярных, генетических и эволюционных аспектов феномена межполушарной асимметрии представляется медоносная пчела, которая при относительно просто устроенной нервной системе, демонстрирует высокий уровень когнитивной деятельности мозга. Помимо способности к выработке общедвигательных и локальных рефлексов на одиночные раздражители или их комплексы пчела демонстрирует способность к выработке простых и сложных тормозных условных связей, а также к абстрактно-логическим операциям, основанным на способности к синтезу, обобщению и категоризации (Лопатина,1971, Лопатина, Чеснокова,1992, Menzel,1999, Giurfa, 2007 и мн.др.).

Кроме того, в отношении медоносной пчелы уже проведен ряд исследований, указывающих на наличие функциональной и морфологической асимметрии (Rogers, Vallortigara, 2008, Frasnelli, Vallortigara, Rogers, 2010, Frasnelli, Anfora, Trona, Tessaroloetal., 2010, Haase, Rigosi, Frasnelli, Tronaetal., 2011 и т.д.). Наибольший интерес представляет выдвинутое, по результатам поведенческих опытов, предположение о том, что разные типы памяти формируются в разных полушариях – кратковременная  в правом полушарии, а долговременная в левом (Frasnelli, Vallortigara, Rogers, 2012).

Однако, анализ литературных источников позволяет заключить, что несмотря на увеличивающееся число публикаций, посвященных, в частности, явлению латерализации у медоносной пчелы на поведенческом уровне (Letzkus, Ribi, Wood, Zhuetal. 2006, Frasnelli, Vallortigara, Rogers, 2010, Frasnelli, Vallortigara, Rogers, 2011), вопрос молекулярно-генетических механизмов данного феномена остается практически неизученным.

Ранее рядом исследований было показано, что уровень экспрессии генов, контролирующих процессы онтогенеза  (морфогенез, дифференцировка и старение клеток) находится под эпигенетическим контролем, который осуществляется через потенциально обратимые модификации генома. Сравнительно недавние эксперименты подтвердили участие ряда ковалентных посттрансляционных модификаций хроматина нейронов мозга также и в когнитивных процессах (Bredy, Wu, Crego, Zellhoeferetal., 2007, Miller, Sweatt, 2007).

Цель исследования.

Целью данной работы явилось исследование уровня метилирования гистона Н3 в ядрах нейронов разных гемисфер мозга при ассоциативном обучении.

Материалы и методы.

В качестве модели ассоциативного обучения использовали обонятельный условный пищевой рефлекс (УР) вытягивания хоботка. Пчел в возрасте 10-14 дней иммобилизовали после холодового наркоза по общепринятой методике [11]. УР вырабатывали путем трехкратного сочетания условного (запах гвоздики) и безусловного стимулов (50% раствор сахарозы). Интервал между сочетаниями — 6 минут.  Пчелы контрольной группы получали 50% раствор сахарозы без сочетания с запахом. В этой модели после завершения процедуры обучения долговременная память сразу достигает дефинитивного уровня [9]. Для исследований отбирали пчел, показавших наличие УР через 1,6 и 24 часа после сеанса обучения. В нашем эксперименте число пчел, сохранивших УР в памяти через 1 и 6 часов, составило 100%, через 24 часа – 78%. Для учета возможного влияния дополнительных факторов на эпигенетический статус нейронов, помимо пчел опытной и контрольной группы была сформирована интактная группа (пчелы, не претерпевающие никаких воздействий) и группа, подвергающаяся воздействию только холодового наркоза. Уровень метилирования гистона Н3 по лизину 4(Н3К4me) в клетках Кеньона грибовидных тел мозга пчел  изучали с помощью иммуногистохимического окрашивания срезов. Биологический материал фиксировали в 10% растворе параформальдегида при комнатной температуре. Дегидратация проводилась в изопропаноле.

При исследовании экспрессии использовали первичные антитела к модифицированному гистону Н3 (К4 methylation (Abcam)) в разведении 1:200. Вторичные антитела – универсальные биотинилированные Quick-kit (Vectastain). Визуализацию реакции с первичным антителом проводили c помощью DAB-набора (Vector).

Препараты анализировали с помощью светового микроскопа Микромед-3, совмещенного с ССD камерой. Оценивали иммуноположительную реакцию клеток в каликсах грибовидных тел. Учитывали интенсивно окрашенные клетки, отличающиеся от общего фона. Для статистической обработки результатов использовали программное обеспечение Rstudio. При построении столбчатых диаграмм использовали среднее значение и стандартную ошибку средней  (m±sem). Проверка отклонения выборок от нормального распределения осуществлялось с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для оценки достоверности различий между исследуемыми характеристиками экспериментальных групп использовался W-критерий Вилкоксона.

Результаты и обсуждение.

На сегодняшний день известно много ковалентных посттрансляционных модификаций хроматина – ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, сумоилирование и убиквитинирование и т.д. Наиболее полно участие в процессе формирования памяти описано для ацетилирования и фосфорилирования гистонов в ядрах нейронов мозга, в то время как процесс метилирования гистонов исследован в меньшей степени.

Метилирование является наиболее сложной ковалентной гистоновой модификацией. Метилирование гистона может происходить по двум аминокислотным остаткам – лизину и аргинину. При этом возможно множественное присоединение метильных групп: лизины могут быть моно-(me1), ди-(me2), или три-(me3)метилированными, аргинины – моно-, и диметилированными. Воздействие на транскрипционную активность хроматина может быть как репрессирующим, так и активирующим.

Shvecov_4_2015_1

Рис.1 Фронтальный срез мозга пчелы с проявлением иммуноположительной реакции клеток после иммуногистохимического окрашивания на метилирование гистона Н3 по lys4 (Abcam,1:200).Вторичное антитело – универсальное биотинилированное (Vectastain). Визуализация с помощью DAB (Vector). Увеличение: ок. х10, об.х 20.Ок. – окуляр; об. – объектив.а) клетки Кеньона, б) нейроны оптической доли c) пул проекционных и локальных нейронов антеннальной доли

Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга пчелы после сеанса ассоциативного обучения антителами против метильной группы гистона Н3 по лизину 4 показало, что положительная иммунореактивность наблюдалась по всему мозгу пчелы (рис.1). Наиболее выраженная интенсивность окраски была зарегистрирована в оптических и антеннальных долях, а также грибовидных телах – высшем интегративном органе насекомых, который является функциональным аналогом гиппокампа позвоночных животных. В оптических долях было отмечено неоднородное распределение антитела – наибольшая экспрессия была отмечена в местах скопления нейронов медулы, лобулы и ламины, в то время как окраска структурированного нейропиля была гораздо менее выраженной. В антеннальных долях наиболее иммунопозитивными были области скопления проекционных и локальных нейронов. В грибовидных телах наиболее интенсивное окрашивание было отмечено в клетках Кеньона.

С помощью метода иммуногистохимического окрашивания  нами впервые были выявлены особенности динамики метилирования гистона Н3 по лизину 4 в нейронах грибовидных тел в процессе формирования долговременной ассоциативной памяти у медоносной пчелы. Было показано, что уровень Н3К4me в нейронах каликсов грибовидных тел после выработки условного рефлекса на запах через 1,6 и 24 часа оказался достоверно более высоким, превышая показатели остальных групп (рис.2).

Shvecov_4_2015_2

Рис.2 Изменение уровня метилирования гистона Н3 по лизину 4 в нейронах грибовидных телах мозга пчелы через: А) 1 час, В) 6 часов, С) 24 часа после сеанса обучения; необуч – группа пчел, не показавших наличие УР спустя 24 часа после обучения, инт – группа интактных пчел, холл — группа пчел, подвергшихся действию холодового наркоза, контр — контрольная группа, обуч — опытная группа; *-достоверные отличия от остальных групп (критерий Вилкоксона, р<0.01).

В ходе анализа распределения иммунопозитивных ядер нейронов каликсов грибовидных тел по разным гемисферам мозга было отмечено, что после сеанса ассоциативного обучения их количество изменяется неравномерно. Через 1 час после сеанса ассоциативного обучения у пчел опытной группы уровень метилирования гистона Н3 по lys4 был достоверно выше в каликсах правого полушария, в то время как в остальных группах подобного явления отмечено не было (рис.3). Спустя 6 часов указанная тенденция сохранялась – ассиметрия процесса метилирования гистона Н3 по lys 4 наблюдалась только в нейронах грибовидных тел пчел опытной группы.

Через 24 часа статус H3K4me в нейронах грибовидных тел правого полушария остается достоверно выше, чем в левом. Обращает на себя внимание группа «необучившихся пчел» у которых также наблюдается процесс асимметрии, имеющий, однако, принципиальное отличие – количество иммунопозитивных нейронов было достоверно выше в каликсах левого полушария (рис.4).

Таким образом, после сеанса ассоциативного обучения происходит неравномерное увеличение уровня метилирования гистона Н3 в разных полушариях мозга, что в свою очередь свидетельствует о неодинаковом уровне экспрессии генов. Результаты сравнения опытной группы с «интактной» и группой подвергшейся воздействию только холодового наркоза, а также группой “необучившихся” пчел, позволяют говорить о том, что асимметрия процесса метилирования гистона Н3 по лизину 4 в нейронах грибовидных тел мозга пчелы связана с процессом формирования, сохранения и/или извлечения долговременной памяти, а не сопутствующими факторами (холод, иммобилизация пчел).

Shvecov_4_2015_3

Рис.3 Изменение уровня метилирования гистона Н3 по лизину 4 в нейронах грибовидных тел правого и левого полушарий мозга пчелы через: А) 1 час, В) 6 часов; необуч – группа пчел, не показавших наличие УР спустя 24 часа после обучения, инт – группа интактных пчел, хол — группа пчел, подвергшихся действию холодового наркоза, контр — контрольная группа, обуч — опытная группа; *-достоверные отличия между правым и левым полушарием (критерий Вилкоксона, р<0.01).

Полученные данные дополняют ранее представленные факты, указывающие на морфологическую и функциональную латерализацию у медоносной пчелы. В частности, исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии позволили выявить неравномерное распределение ольфакторных сенсилл между  антеннами: на правой количество сенсилл было достоверно выше, чем на левой (Frasnelli, Anfora, Trona, Tessaroloetal., 2010, Haase, Rigosi,  Frasnelli, Tronaetal., 2011). Эти данные были подтверждены электрофизиологическими экспериментами во время предъявления запаха: среднее значение рецепторного потенциала, регистрируемого в правой антенне было достоверно выше, чем в левой (Haase, Rigosi,  Frasnelli, Tronaetal., 2011). Отметим также, что среди беспозвоночных животных функциональная латерализация памяти была показана на виноградной улитке (Шевченко, Данилова, Гринкевич, 2009). Было установлено, что при выработке рефлекса пищевой аверзии активация MAPK/ERK каскада и ацетилирование гистона Н3 происходит в командных нейронах только правого полушария.

Shvecov_4_2015_4 Рис.4 Изменение уровня метилирования гистона Н3 по Lys4 в грибовидных тел правого и левого полушарий мозга пчелы через 24 час после сеанса обучения; необуч — группа пчел, не показавших наличие УР спустя 24 часа после обучения, инт – группа интактных пчел, хол — группа пчел, подвергшихся действию холодового наркоза, контр — контрольная группа, обуч — опытная групп; р

Выводы.

Таким образом, в ходе экспериментальных исследований было выяснено, что формирование, сохранение и/или извлечение долговременной памяти у медоносной пчелы сопровождается процессом метилирования гистона Н3 по лизину 4 и, соответственно, активацией транскрипционной активности хроматина нейронов грибовидных тел. При этом, сохранение условного рефлекса на обонятельный раздражитель в памяти сопровождается асимметрией процессов ремоделирования хроматина — уровень метилирования гистона Н3 в правом полушарии мозга после сеанса обучения становится достоверно выше, чем в левом. Полученные данные, по нашему мнению, могут служить платформой для дальнейшего изучения процессов эпигенетической регуляции обучения и памяти.

 

Список литературы.
  1. Бианки В.Л. Механизмы парного мозга. — Л. – Наука. -1989. — 263 с.
  2. Бианки В.Л., Филиппова Е.В. Асимметрия мозга и пол. — Изд. СПб. Унив. – 1997. — 227 с.
  3. Лопатина Н.Г. Сигнальная деятельность в семье медоносной пчелы. — Л. -  Наука. — 1971. — 272 с.
  4. Лопатина Н.Г., Чеснокова Е.Г. Условные рефлексы и память медоносной пчелы // Журн. высш.нерв. деят.-1992.-42 (5)- C. 890–903.
  5. Шевченко К.Г., Данилова А.Б., Гринкевич Л.Н.  Пострансляционная модификация гистона Н3 при консолидации и реконсолидации памяти у моллюска Helix // Вестник ВОГиС.-2009.-Том 13.-№ 4.- С.723-730.
  6.  Bredy T.W., Wu H., Crego C., Zellhoefer J., Sun Y.E., Barad M. Histone modifications around individual BDNF gene promoters in prefrontal cortex are associated with extinction of conditioned fear // Learn Mem.-2007.-V.14.-P.268–276.
  7.  Frasnelli E, Vallortigara G, Rogers LJ. Left-right asymmetries of behaviour and nervous system in invertebrates // Neurosci Biobehav Rev.-2012.-36(4)-P.1273-91
  8.  Frasnelli,  E.,  Anfora,  G.,  Trona,  F.,  Tessarolo,   F.,  Vallortigara,   G.,    Morpho-functional   asymmetry  of   the   olfactory  receptors   of   the  honeybee   (Apis   mellifera) // Behav   Brain  Res.- 2010.-209.-P.221–225.
  9.  Frasnelli,  E.,  Vallortigara,   G.,  Rogers,  L.J.,  Right-left  antennal  asymmetry  of odour   memory  recall   in   three   species  of   Australian   stingless  bees // Behav. Brain Res.- 2011.-224 (1).-P.121–127.
  10.  Frasnelli,  E.,  Vallortigara,   G.,  Rogers,  L.J., Response  competition   associate with  right-left  antennal  asymmetries  of   new  and   old  olfactory  memory  trace in   honeybees // Behav. Brain Res.- 2010-209.-P.36–4.
  11.  Giurfa M.  Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well // J. Comp. Physiol. (Ser. A). Neuroethol. Sens.Neural. Behav. Physiol.-2007.-193(8)-P.801–824.
  12.  Haase A., Rigosi E., Frasnelli E., Trona F., Tessarolo F., Vinegoni C., Anfora G., Vallortigara G., Antolini R. A multimodal approach for tracing lateralisation along the olfactory pathway in the honeybee through electrophysiological recordings, morpho-functional imaging, and behavioural studies // European Biophysics Journal.- 2011.-V.40.-P.1247-58.
  13. Letzkus P., Ribi W.A., Wood J.T., Zhu H., Zhang S.W., Srinivasan M.V. Lateralization of Olfaction in the Honeybee Apis mellifera // Curr Biol.-2006.-V.16.- P. 1471–1476.
  14. MenzelR. Memory dynamics in the honeybee // J. Comp. Physiol. (Ser. A).- 1999.-185-P.323-340.
  15. Miller C.A., Sweatt J.D. Covalent modification of DNA regulates memory formation // Neuron.-2007.-V.53.-P.857–869.
  16. Rogers LJ, Vallortigara G. From antenna to antenna: lateral shift of olfactory memory in honeybees // PLoS One.-2008.-3-e2340. 
Комментарии и пинги к записи запрещены.

Комментарии закрыты.

Дизайн: Polepin